Vooltsütomeetria on tsütoloogiline uurimismeetod, mida kasutatakse rakkude süvaanalüüsiks. Selle eeliseks on see, et see võimaldab teil uurida iga rakku eraldi. Seda tüüpi analüüs aitab hinnata mitut parameetrit sadades lahtrites mõne sekundiga. Seetõttu peetakse tsütofluoromeetriat üheks kiireimaks ja täpseimaks analüüsimeetodiks, mis praegu teadlastele ja arstidele kättesaadav on.
Põhimõte
Vooltsütomeetria põhimõte põhineb rakkude valguse hajumise ja luminestsentsi (fluorestsentsi) mõõtmisel. Rakususpensioon juhitakse suure kiirusega joana läbi tsütomeetri raku, kus seda kiiritatakse laseriga. Seal tehakse ka nn hüdrodünaamilist teravustamist. Selle mehhanism seisneb selles, et rakust väljuv vool koos uuritud osakestega väljalaskeavas voolab välise juga, millel on suurem kiirus. Selle tulemusena joonduvad osakesed järjestatud ahelas.
Eelrakud on märgistatud spetsiaalsete fluorestsentsvärvidega (fluorokroomidega). Tänu neile laserkiirergastab sekundaarset sära. Vastuvõetud valgussignaalid registreerivad detektorid. Seejärel töödeldakse teavet tarkvaraalgoritmide abil, mis võimaldavad teil loendada üksikuid rakupopulatsioone, mis erinevad teatud kriteeriumide poolest.
Uuringud tavapärase mikroskoopiaga ei suuda sageli eri rakke eristada, kuna need näevad välja ühesugused. Tsütofluorimeetria võib anda muid andmeid (DNA struktuuri terviklikkus), analüüsida valgu ekspressiooni, rakkude ellujäämist.
Kuna fluorokroomide ergastamiseks on vaja erineva lainepikkusega valguskiiri, aga ka erinevat tüüpi detektoreid, on kaasaegsed paigaldised varustatud mitme tuvastuskanaliga (4 kuni 30). Laserkiirgurite arv võib olla 1 kuni 7. Keerulisemad seadmed võimaldavad mitme parameetriga uurida osakeste mitut omadust korraga.
Eelised ja puudused
Voolutsütomeetria eelised on järgmised:
- suur töötlemiskiirus (kuni 30 tuhande sündmuse registreerimine 1 sekundi jooksul);
- võimalus uurida suurt hulka rakke (kuni 100 miljonit proovis);
- Fluorestsentsvalguse intensiivsuse kvantifitseerimine;
- iga lahtri analüüs;
- heterogeensete protsesside samaaegne uurimine;
- andmete automaatne eraldamine rakupopulatsioonide järgi;
- tulemuste kvaliteetne visualiseerimine.
Selle tehnoloogia teine omadus on seeanalüüsitavat osakest saab värvida mitme fluorestseeruva lahusega. Tänu sellele toimub mitme parameetriga uuring.
Miinuseks on tehniliste seadmete keerukus ja vajadus spetsiaalse proovi ettevalmistamise järele.
Tsütomeetrid
Esimesed seda tüüpi seadmed ilmusid Saksamaal juba 1968. aastal, kuid laiem alt levisid need palju hiljem. Praegu võib kõik voolutsütomeetria meetodil töötavad seadmed jagada kahte tüüpi:
- seadmed, mis mõõdavad fluorestsentskiirgust (kaks või enam lainepikkust), 10° ja 90° valguse hajumist (madala nurga ja külghajumise detektor);
- seadmed, mis lisaks mitmete mobiilsideparameetrite mõõtmisele sortivad automaatselt nende kriteeriumide alusel rühmadesse.
Edasi hajumise detektor on loodud raku suuruse määramiseks ja külghajumise seade võimaldab teil saada teavet rakusiseste graanulite olemasolu, tsütoplasma ja tuuma mahusuhte kohta.
Klassikalised tsütomeetrid, erinev alt valgusmikroskoopidest, ei võimalda rakust pilti saada. Viimastel aastatel on aga välja töötatud kombineeritud seadmeid, mis suudavad ühendada mikroskoobi ja tsütofluorimeetri võimalused. Neid arutatakse allpool.
Kujutised tsütomeetrid
Klassikalises voolutsütomeetrias kasutatavate instrumentide puhul,Iseloomulik on üks tunnus: kui analüüsitavate rakkude populatsioonis registreeritakse haruldasi sündmusi, siis ei saa kuidagi hinnata, mis on nende olemus. Need osakesed võivad olla kas surnud rakkude jäänused või nende haruldane rühm. Tavalistes seadmetes jäetakse sellised andmed sündmuste üldisest voost välja, kuid just need võivad olla teadusliku ja kliinilise analüüsi jaoks eriti väärtuslikud.
Uue põlvkonna kujutise voolutsütomeetrid võimaldavad teil jäädvustada pilti igast detektoritsooni läbivast voolust läbivast rakust. Seda on lihtne näha, klõpsates diagrammi vastaval alal, mis kuvatakse arvutimonitoril.
Kasutusvaldkonnad
Vooltsütomeetria on universaalne meetod, mida kasutatakse paljudes meditsiini ja teaduse valdkondades:
- immunoloogia;
- onkoloogia;
- transplantoloogia (punase luuüdi, tüvirakkude siirdamine);
- hematoloogia;
- toksikoloogia;
- biokeemia (rakusisese happesuse mõõtmine, muude parameetrite uurimine);
- farmakoloogia (uute ravimite loomine);
- mikrobioloogia;
- parasitoloogia ja viroloogia;
- okeanoloogia (fütoplanktoni uurimine veekogude seisundi hindamiseks ja muud ülesanded);
- nanotehnoloogia ja mikroosakeste analüüs.
Immunoloogia
Inimese immuunsüsteem koosneb väga erinevatest rakkudest. Voolutsütomeetria immunoloogias võimaldab hinnata nende struktuuri ja funktsioone, st teostada morfofunktsionaalsetanalüüs.
Sellised uuringud aitavad mõista immuunsuse keerulist olemust. Rakkude fenotüübid muutuvad antigeenide aktiveerimise, patoloogiate arengu ja muude tegurite tõttu. Tsütofluoromeetria abil saab eraldada immuunrakkude alampopulatsioonid keerulises segus ja hinnata kõiki nende muutusi aja jooksul.
Onkoloogia
Onkoloogia üks olulisemaid ülesandeid on rakkude eristamine nende tüübi järgi. Voolutsütomeetria analüüsi põhimõte onkohematoloogias põhineb järgmisel nähtusel: kui proovi töödeldakse spetsiaalse fluorestseeruva värvainega, seostub see tsütoplasma valkudega. Pärast jagunemist aktiivselt vohavates rakkudes väheneb selle sisaldus poole võrra. Vastav alt sellele väheneb raku luminestsentsi intensiivsus kaks korda.
Prolifereeruvate rakkude tuvastamiseks on ka teisi viise:
- DNA-d siduvate värvainete (propiidiumjodiid) kasutamine;
- märgistatud uratsiili kasutamine;
- rakutsükli reguleerimises osalevate tsükliinvalkude suurenenud ekspressioonitaseme registreerimine.
