Kromatograafia on üks ainete eraldamise meetodeid. Seda kasutatakse järgnevaks mikroosakeste füüsikaliste ja keemiliste omaduste kvalitatiivseks ja kvantitatiivseks analüüsiks. Selle tehnoloogia variatsioon on afiinsuskromatograafia. Valguühendite eristamise idee molekulaarse afiinsuse omaduse abil on teaduses tuntud juba mitu aastakümmet. Kuid see on arenenud alles viimastel aastatel pärast maatriksina kasutatavate väga poorsete hüdrofiilsete materjalide kasutuselevõttu. See meetod võimaldab lahendada nii analüütilisi probleeme (ainete eraldamine ja identifitseerimine) kui ka ettevalmistusülesandeid (puhastamine, kontsentreerimine).
Essence
Afiinsuskromatograafia (ladina sõnast affinis - "külgnev", "seotud") põhineb afiinsusinteraktsioonidel, milleks on väga spetsiifiliste sidemete moodustumine speissermolekuli (ligand või affintne) ja sihtmolekuli vahel. Need mehhanismid on looduses lai alt levinud (mediaatorite ehk hormoonide ja retseptorite seos, antikehad jaantigeenid, polünukleotiidide hübridisatsioon ja muud tüüpi protsessid). Meditsiinis on afiinsuskromatograafiat praktilistel eesmärkidel kasutatud alates 1951. aastast
Komponendid on eraldatud järgmiselt:
- eraldatavat ainet sisaldav töölahus lastakse läbi sorbendi;
- sorbentmaatriksile ladestunud ligand säilitab selle aine;
- see on kontsentreeritud (akumuleeruv);
- eraldatud aine ekstraheerimine sorbendist lahustiga pesemise teel.
See meetod võimaldab eraldada terveid rakke. Erinevus traditsioonilisest sorptsioonkromatograafiast seisneb selles, et eraldatud komponendil on tugev biospetsiifiline seondumine sorbendiga, mida iseloomustab kõrge selektiivsus.
Adsorbendid
Adsorbentidena kasutatakse järgmisi aineid:
- Geelühendid, mis põhinevad agaroosil, agarist saadud polüsahhariidil. Kõige sagedamini kasutatakse 3 sorti: sepharose 4B, CL (ristseotud agaroos) ja affi-gel. Viimane koostis on agaroosi ja polüakrüülamiidi modifitseeritud geel. Sellel on suurem bioloogiline inertsus, kõrge keemiline ja termiline vastupidavus.
- Ränidioksiid (silikageel).
- Klaas.
- Orgaanilised polümeerid.
Mehaaniliste takistuste kõrvaldamiseks ligandiga kokkupuutel kasutatakse selle kandjast eraldamiseks lisaaineid (peptiidid, diamiinid, polüamiinid, oligosahhariidid).
Varustus
Afiinsuskromatograafia seadmed sisaldavad järgmisi põhiseadmeid:
- säilituspaaki liikuva faasi jaoks (eluent);
- kõrgsurvepumbad keskmise toiteallika jaoks (enamasti edasi-tagasi liikumisega);
- filter eluentide tolmust puhastamiseks;
- doseerimisseade;
- kromatograafiline kolonn segu eraldamiseks;
- detektor veerust lahkuvate eraldatud komponentide tuvastamiseks;
- kromatogrammsalvestid ja mikroprotsessorüksus (arvuti).
Lahustunud õhu hulga vähendamiseks juhitakse heelium esm alt läbi liikuva faasi. Eluendi kontsentratsiooni muutmiseks paigaldatakse mitu pumpa, mida juhib programmeerija. Kromatograafilised kolonnid on valmistatud roostevabast terasest (korrosioonikindluse suurendamiseks), klaasist (universaalne valik) või akrüülist. Ettevalmistavatel eesmärkidel võib nende läbimõõt varieeruda vahemikus 2 kuni 70 cm. Analüütilises kromatograafias kasutatakse mikrokolonne Ø10-150 µm.
Andurite tundlikkuse suurendamiseks lisatakse segusse reaktiive, mis soodustavad ainete moodustumist, mis neelavad rohkem kiiri spektri ultraviolett- või nähtavas piirkonnas.
Metoodika
Vedeliku afiinsuskromatograafiat on 2 peamist tüüpi:
- Kolonn, milles kolonn täidetakse statsionaarse faasiga ja sellest juhitakse vooluga läbi segueluent. Eraldumine võib toimuda rõhu või raskusjõu mõjul.
- Õhuke kiht. Eluent liigub kapillaarjõudude mõjul mööda lamedat adsorbendikihti. Adsorbenti kantakse klaasplaadile, keraamilisele või kvartsvardale, metallfooliumile.
Peamised tööetapid on järgmised:
- adsorbendi valmistamine, ligandi fikseerimine kandjale;
- eraldussegu söötmine kromatograafilisse kolonni;
- mobiilfaasi laadimine, komponendi sidumine ligandiga;
- faasi asendamine seotud aine eraldamiseks.
Sihtkoht
Afiinsuskromatograafiat kasutatakse järgmist tüüpi ainete eraldamiseks (kasutatud ligandi tüüp on märgitud sulgudes):
- ensümaatiliste inhibiitorite, substraatide ja kofaktorite (ensüümide) analoogid;
- bioorgaanilised ained, millel on geneetilise võõrapärasuse tunnused, viirused ja rakud (antikehad);
- kõrge molekulmassiga süsivesikud, monosahhariidpolümeerid, glükoproteiinid (lektiinid);
- tuumavalgud, nukleotidüültransferaasid (nukleiinhapped);
- retseptorid, transportvalgud (vitamiinid, hormoonid);
- valgud, mis interakteeruvad rakumembraanidega (rakkudega).
Seda tehnoloogiat kasutatakse ka immobiliseeritud ensüümide saamiseks ja nende sidumine tselluloosiga võimaldab toota immunosorbente.
DNA-d siduvate valkude kromatograafia
DNA-d siduvate valkude eraldamine toimub kasutadeshepariin. See glükoosaminoglükaan on võimeline siduma paljusid molekule. Selle rühma valkude afiinsuskromatograafiat kasutatakse selliste ainete eraldamiseks nagu:
- translatsiooni initsiatsiooni ja pikenemise tegurid (nukleiinhappemolekulide ja valkude süntees);
- restrictaasid (ensüümid, mis tunnevad ära teatud järjestused kaheahelalises DNA-s);
- DNA ligaasid ja polümeraasid (ensüümid, mis katalüüsivad kahe molekuli liitumist uue keemilise sideme moodustamiseks ja osalevad DNA replikatsioonis);
- seriini proteaasi inhibiitorid, mis mängivad olulist rolli immuun- ja põletikulistes protsessides;
- kasvufaktorid: fibroblast, Schwann, endoteel;
- tsellulaarse maatriksi valgud;
- hormooni retseptorid;
- lipoproteiinid.
Väärikus
See meetod on üks spetsiifilisemaid reaktiivsete ühendite (ensüümid ja suuremad agregaadid – viirused) eraldamiseks. Siiski ei kasutata seda mitte ainult bioloogiliselt aktiivsete ainete isoleerimiseks.
Antikehade tuvastamine väikestes kogustes, polüadenüülhappe kvantitatiivne hindamine, dehüdrogenaaside molekulmasside kiire määramine, teatud saasteainete eemaldamine, trüpsiini inaktiivse vormi aktiveerimise kineetika, inimese molekulaarstruktuuri uurimine interferoonid – see ei ole kogu uuringute loetelu, milles afiinsust kasutatakse.kromatograafia. Kasutamine kliinikus on tingitud selle eelistest, näiteks:
- Tõhus puhastusvõimevalgud, polüsahhariidid, nukleiinhapped. Need erinevad veidi oma füüsikaliste ja keemiliste omaduste poolest ning kaotavad aktiivsuse hüdrolüüsi, denatureerimise ja muude meetoditega kasutatava töötlemise ajal.
- Ainete eraldumise kiirus, protsessi dünaamiline iseloom.
- Dissotsiatsioonikonstantide määramiseks pole vaja spetsiaalset ensüümpuhastust ja isoensüümide homogeniseerimist.
- Suudab eraldada paljusid aineid.
- Madal ligandide tarbimine.
- Ainete eraldamise võimalus suurtes kogustes.
- Bioloogiliste makromolekulide sidumise pöörduv protsess.
Seda tehnikat saab kombineerida teistega, et kehtestada lisaväli (gravitatsiooniline, elektromagnetiline). See võimaldab laiendada kromatograafia tehnilisi võimalusi.
Ensümaatiline tehnika
Tänu sellele meetodile algas biotehnoloogia uue haru – ensüümtehnoloogia aktiivne arendamine.
Afiinsuskromatograafial ensüümisolatsiooni jaoks on järgmised eelised:
- ensüümide saamine suurtes kogustes lühema aja tulemusena, mille tulemusena - nende hind;
- ensüümide immobiliseerimine võib oluliselt laiendada nende rakendusala meditsiinis ja tööstuses;
- Ensüümide seostamine lahustumatu tahke kandjaga võimaldab uurida looduslikes ja füsioloogilistes protsessides olulist rolli mängiva mikrokeskkonna mõju ja reaktsioonide suunda.
