Rekombinantne DNA on molekulid, mis on moodustatud laboratoorsete geneetiliste rekombinatsioonimeetoditega, et kombineerida mitmest allikast pärit geneetilist materjali. See on võimalik, kuna kõigi organismide DNA molekulidel on sama keemiline struktuur ja need erinevad ainult selles sisalduva nukleotiidjärjestuse poolest.
Loomine
Molekulaarne kloonimine on laboriprotsess, mida kasutatakse rekombinantse DNA loomiseks. See on üks kahest kõige laialdasem alt kasutatavast meetodist koos polümeraasi ahelreaktsiooniga (PCR). See võimaldab teil kontrollida mis tahes konkreetse katsetaja valitud DNA järjestuse replikatsiooni.
Rekombinantse DNA meetodite vahel on kaks põhimõttelist erinevust. Üks on see, et molekulaarne kloonimine hõlmab replikatsiooni elusrakus, PCR aga in vitro. Teine erinevus seisneb selles, et esimene meetod võimaldab lõigata ja kleepida DNA järjestusi, samas kui teist täiustatakse olemasoleva järjestuse kopeerimisega.
Vektor-DNA
Rekombinantse DNA saamiseks on vaja kloonimisvektorit. See on saadud plasmiididest või viirustest ja on suhteliselt väike segment. Molekulaarse kloonimise vektori valik sõltub peremeesorganismi valikust, kloonitava DNA suurusest ja sellest, kas ekspresseeritakse võõrmolekule. Segmente saab kombineerida erinevate meetoditega, nagu restriktsiooniensüümi/ligaasi kloonimine või Gibsoni kokkupanek.
Kloonimine
Standardprotokollides hõlmab kloonimine seitset sammu.
- Valige peremeesorganism ja kloonimisvektor.
- DNA vektori hankimine.
- Kloonitud DNA moodustumine.
- Rekombinantse DNA loomine.
- Selle toomine peremeesorganismi.
- Seda sisaldavate organismide valik.
- Kloonide valik soovitud DNA insertide ja bioloogiliste omadustega.
Pärast peremeesorganismi siirdamist võivad rekombinantses konstruktis sisalduvad võõrmolekulid ekspresseerida, aga ei pruugi. Ekspressioon nõuab geeni ümberstruktureerimist, et hõlmata järjestusi, mis on vajalikud DNA tootmiseks. Seda kasutab hosti tõlkemasin.
Kuidas see toimib
Rekombinantne DNA töötab siis, kui peremeesrakk ekspresseerib rekombinantsetest geenidest pärinevat valku. Ekspressioon sõltub geeni ümbritsemisest signaalide komplektiga, mis annavad juhiseid selle transkriptsiooniks. Nende hulka kuuluvad promootor, ribosoomi sidumine ja terminaator.
Probleemid tekivad, kui geensisaldab introneid või signaale, mis toimivad bakteriaalse peremehe terminaatoritena. See toob kaasa enneaegse lõpetamise. Rekombinantne valk võib olla valesti töödeldud, volditud või lagunenud. Selle tootmine eukarüootsetes süsteemides toimub tavaliselt pärm- ja niitseentes. Loomapuuride kasutamine on keeruline, kuna paljude jaoks on vaja tugevat tugipinda.
Organismide omadused
Rekombinantseid DNA molekule sisaldavatel organismidel on ilmselt normaalsed fenotüübid. Nende välimus, käitumine ja ainevahetus tavaliselt ei muutu. Ainus viis rekombinantsete järjestuste olemasolu demonstreerimiseks on uurida DNA-d, kasutades polümeraasi ahelreaktsiooni testi.
Mõnel juhul võib rekombinantsel DNA-l olla kahjulik mõju. See võib juhtuda, kui selle aktiivset promootorit sisaldav fragment asub varem vaikiva peremeesraku geeni kõrval.
Kasuta
Rekombinantse DNA tehnoloogiat kasutatakse laialdaselt biotehnoloogias, meditsiinis ja teadusuuringutes. Selle valke ja muid tooteid võib leida peaaegu igast Lääne apteegist, veterinaarkliinikust, arsti kabinetist, meditsiini- või bioloogilisest laborist.
Kõige levinum rakendus on alusuuringutes, kus tehnoloogia on suures osas tänapäeva töös bioloogia- ja biomeditsiiniteadustes hädavajalik. Rekombinantset DNA-d kasutatakse geenide tuvastamiseks, kaardistamiseks ja järjestamiseks ning nende määramiseksfunktsioonid. rDNA sonde kasutatakse geeniekspressiooni analüüsimiseks üksikutes rakkudes ja tervete organismide kudedes. Laboratoorsetes katsetes kasutatakse reagentidena rekombinantseid valke. Mõned konkreetsed näited on toodud allpool.
Rekombinantne kümosiin
Kümosiin on juustu valmistamiseks vajalik ensüüm, mida leidub abomasumis. See oli esimene geneetiliselt muundatud toidu lisaaine, mida tööstuses kasutati. Mikrobioloogiliselt toodetud rekombinantne ensüüm, mis on struktuurilt identne vasikatest pärineva ensüümiga, on odavam ja seda toodetakse suuremates kogustes.
Rekombinantne iniminsuliin
Asendas praktiliselt loomsetest allikatest (nt sead ja veised) saadud insuliini insuliinist sõltuva diabeedi raviks. Rekombinantne insuliin sünteesitakse iniminsuliini geeni viimisel perekonna Eterichia või pärmi bakteritesse.
Kasvuhormoon
Määratud patsientidele, kelle hüpofüüs ei tooda normaalse arengu toetamiseks piisav alt kasvuhormooni. Enne kui rekombinantne kasvuhormoon kättesaadavaks sai, saadi seda surnukehade hüpofüüsist. See ohtlik tegevus on põhjustanud mõnel patsiendil Creutzfeldt-Jakobi tõve.
Rekombinantne hüübimisfaktor
See on verd hüübiv valk, mida manustatakse veritsushäiretega hemofiilia vormidega patsientidele. Nad ei suuda tootafaktor VIII piisavas koguses. Enne rekombinantse VIII faktori väljatöötamist valmistati valku mitmelt doonorilt saadud suures koguses inimvere töötlemise teel. Sellega kaasnes väga suur oht nakkushaiguste edasikandumiseks.
HIV-nakkuse diagnoos
Kõik kolmest laialdaselt kasutatavast HIV-nakkuse diagnoosimise meetodist töötati välja rekombinantse DNA abil. Antikehade test kasutab tema valku. See tuvastab HIV-i geneetilise materjali olemasolu, kasutades pöördtranskriptsiooni polümeraasi ahelreaktsiooni. Testi väljatöötamine sai võimalikuks tänu HIV-i genoomide molekulaarsele kloonimisele ja sekveneerimisele.
