PCR ehk polümeraasi ahelreaktsioon on keerukas laboritehnika, mida kasutatakse laialdaselt meditsiinis ja muudes teadusvaldkondades. PCR-diagnostika sai omal ajal tõeliseks läbimurdeks teaduses.
Kirjeldus
Kvantitatiivne PCR on teatud tüüpi reaalajas PCR.
Selle all mõistetakse PCR-i varianti, mille käigus registreeritakse pidev alt reaktsiooni kineetikat, mis võimaldab kvalitatiivselt hinnata spetsiifiliste DNA nukleotiidjärjestuste sisaldust keerulises molekulaarses segus.
Kvantitatiivset PCR-meetodit käsitletakse üksikasjalikum alt allpool.
Analüüsi olemus
Nakkuste diagnoosimiseks kasutatakse eriti sageli kultuurilisi ja seroloogilisi meetodeid. Esimese raames määratakse nakkusliku patogeeni antikehad vereseerumis. Teises kasutatakse haigelt inimeselt võetud bioloogilist materjali, et külvata spetsiifilist söödet, mis on soodne patogeenide kolooniate kasvuks. Diagnostika mõlemasjuhtum võib kesta päevi või nädalaid.
PCR-uuringut saab teha erinevate bioloogiliste materjalidega, mis on saadud haigelt inimeselt. Veri ja muud patoloogilised, füsioloogilised ja bioloogilised keskkonnad ja vedelikud toimivad proovidena. Saate teha PCR-i väljaheiteid või uriini.
Ebatüüpilisi ja viirusnakkusi diagnoositakse kõige sagedamini kvantitatiivse PCR-iga, kuna neid ei pruugi olla lihtne diagnoosida nende põhjustatud patoloogilise protsessi eripära tõttu. Selliste infektsioonide kindlakstegemiseks kulub aega, mille jooksul hakkavad organismis tootma seroloogiliste meetoditega määratud antikehad. Kuid see on mõnel juhul vastuvõetamatu.
Teostusviis
PCR meetod – nakkuse laboratoorne tuvastamine patsiendilt eraldatud proovides (in vitro).
Polümeraasi ahelreaktsiooni läbiviimiseks on vaja spetsiaalseid reaktiive.
Katsematerjal sisestatakse reaktiividega katseklaasidesse. Katseklaasid asetatakse spetsiaalsesse aparaadisse - PCR-võimendisse, mis on mõeldud soovitud RNA või DNA fragmentide võimendamiseks (arvu suurendamiseks), PCR-võimendi töötab tsüklilises režiimis. Igas tsüklis, kui proovid sisaldavad patogeeni RNA või DNA järjestust, koguneb lahusesse nende nukleiinhapete osakeste koopiaid järjest rohkem. Saate määrata patogeeni olemasolu ja selle koguse proovides.
PCR tüübid
Kvalitatiivne analüüs PCR abil võimaldab saada järgmise tulemuse:
- negatiivne, kui huvipakkuvat patogeeni proovidest ei leitud;
- positiivne, kui proovidest leitakse järjestusi, mis on iseloomulikud konkreetsele patogeenile.
Positiivse PCR-tulemuse korral võime 95% täpsusega rääkida diagnoositud infektsiooni olemasolust. Samal ajal ulatub diagnostilistel eesmärkidel kasutatavate PCR-komplektide täpsus 100% -ni.
Tavaliselt 5% valedest tulemustest määrab inimfaktor. Näiteks võib analüüsi ja reaktiivide säilitamise tehnika rikkumine oluliselt vähendada uuringu täpsust.
Kvantitatiivne PCR määratleb viiruskoormuse mõiste. On võimalik kindlaks teha, mitu patogeeni DNA komplekti oli patsiendilt võetud proovides.
Nakkuse raskusaste on otseselt võrdeline nende arvu suurenemisega. Samuti saate määrata ravi edukuse viiruskoormuse vähendamiseks.
PCR-i biomaterjali esitamine
Kvantitatiivne PCR viiakse läbi kliinikus, peamiselt hommikuti. Arsti visiidil antakse patsiendile teada, mida ta peab võtma: kraapimine, määrdumine, uriin või veri. PCR suudab tuvastada patogeene olenemata materjali saastatuse tasemest.
Positiivse analüüsi jaoks on teoreetiliselt nõutav ainult ühe patogeeni olemasolu proovides. Praktikas püütakse luua veelgi soodsamaid tingimusi. Selle jaoks on mõned soovitused:
- kui nad võtavad suguelunditelt kraapimise või tampoonielundid, peate kolm päeva enne uuringut hoiduma intiimsest vahekorrast;
- enne analüüsi ei saa antibakteriaalsete ravimitega dušitada ega end pesta;
- kolm tundi enne kusiti määrdumise võtmist peate olema kannatlik ja mitte tühjendama oma soolestikku.
Ära järgi neid reegleid verd loovutades.
Kuidas tõlgendatakse kvantitatiivse PCR analüüsi tulemusi?
Saadud tulemuste kvantitatiivne hindamine
Paljudes kliinilistes olukordades ilmneb ravi efektiivsuse ja/või patoloogilise protsessi dünaamika probleem. Sellised küsimused on eriti aktuaalsed krooniliste infektsioonidega (inimese immuunpuudulikkuse viirus, B- ja C-hepatiit) inimeste uurimisel. Diagnoosimisel lähtutakse sellest, et amplikonide (PCR-produktide) kuhjumine on võrdeline soovitud geeni koopiate olemasoluga analüüsitavas proovis.
Muidugi, võttes arvesse kvantitatiivse PCR tulemusi, tehakse geelelektroforees koos spetsiaalsete PCR signaalide intensiivsuse uurimisega. Samuti on saadud tulemuste korrektse kvantitatiivse hindamise eelduseks positiivsed usaldusväärsed kontrollproovid, mis sisaldavad teadaolevat arvu soovitud geeni koopiaid (näiteks tuhat C-hepatiidi geeni koopiat ühe PCR reaktsiooni kohta). Mitmed kvantitatiivse kontrolli seerialahjendused võimaldavad luua kalibreerimiskõveraid ja neid kasutatakse kliiniliste proovide kliiniliste genokoopiate sisalduse hindamiseks.
Kvantitatiivse PCR määratluses on peamiseks saavutuseks olnud loominefluorestseeruvad DNA sondid, mis lisatakse reaktsioonisegule samaaegselt lihtsate praimeritega ja võimaldavad teil jälgida PCR-i protsessi ajas, st reaalajas PCR-i.
TaqMani metoodika viitab fluorestseeruvate DNA-sondide sünteesile, mis on spetsiifilised amplikoni keskosale ja mille otstes on kaks märgist. Üks neist on fluorestsentsmärgis, teine on selle fluorestsentsi summutav molekul.
Spetsiaalne seade, mis on fluorimeetri ja termoplokk-võimendi hübriid, mõõdab pidev alt igas katseklaasis fluorestsentsi (reaalajas PCR põhimõte). Pärast 20–40 PCR-i tsüklit saadakse iga proovi jaoks individuaalsed kõverad. Testproovis sisalduva soovitud geeni koopiate arvu saab arvutada kontrollproovide kalibreerimiskõverate põhjal.
Samuti on fluorestsentsmeetodil PCR-i rakendamise oluliseks tunnuseks see, et tulemusi arvesse võttes ei ole vaja PCR-i seguga katsuteid avada. See vähendab ruumi saastumise võimalust võimendustoodetega ja elektroforeesi jaoks pole vaja eraldada spetsiaalseid tööpiirkondi.
Mida näitab kvantitatiivne PCR ärakiri?
Mida avastatakse?
Sellise meetodi nagu kvantitatiivne PCR abil leitakse kvalitatiivsed muutused geenides: insertsioonid, deletsioonid ja punktmutatsioonid. Kuid mõnede pärilike häirete korral ilmnevad vastavad sümptomid vastusena teatud geenide sisalduse muutumisele.
AitähKvantitatiivne analüüs annab numbrilise tulemuse, enamasti RÜ / ml. See tähendab, et ühest milliliitrist uuritavast proovist leiti rahvusvahelistes ühikutes mõõdetuna teatud arv patogeeni RNA või DNA koopiaid.
Sõltuv alt ulatusest diagnoositakse infektsiooni raskusaste. Tavaliselt analüüsitakse verd viiruskoormuse määramiseks, kuna viirused liiguvad haiguse ajal veres vab alt.
Funktsioonid
Kvantitatiivsel PCR-il vereanalüüsis on kaks omadust.
- Analüüs viiakse läbi praimerite või desoksüribonukleosiidtrifosfaatide juuresolekul, mis on moodustunud PCR-produkti sisalduse täpseks määramiseks märgistatud fluorestseeruva või radioaktiivse märgisega.
- PCR-protsessis lõpetage reaktsioon varakult, enne kui ilmub liiga palju PCR-tooteid. See on tingitud asjaolust, et küllastumise lõppfaasis, kui PCR-produkte on palju, toimivad nii ensüüm ise kui ka substraadid selle reaktsiooni piiravate lülidena. Järgmise PCR-tsükli lõppu sellistes tingimustes ei iseloomusta enam PCR-i produktide arvu kahekordistumine, tasandatakse ebaolulised kvantitatiivsed erinevused erinevate proovide vahel, mis on üsna selgelt määratletud varases staadiumis pärast rea reaktsioonitsüklite läbimist..
PCR-diagnostika maksumus
PCR-uuringul on kulu, mis sõltub sellest, millist nakkust testitakse, analüüsimetoodikast ja katsematerjalist. Ühe nakkuse kindlakstegemiseks peate andma oma piiri200-800 rubla. Lisandub ka tasu biomaterjali võtmise eest - ligikaudu 400 rubla.
